Preparação de lâmina histológica: Fixação

Biologia

30/01/2013

O princípio fundamental de uma boa preparação histológica é a fixação, que deve ser completa e adequada. Os principais objetivos da fixação são:


-Inibir ou interromper a autólise tecidual;

-Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as substâncias insolúveis;

- Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos técnicos posteriores;

-Preservar os vários componentes celulares e tissulares;

- Melhorar a diferenciação ótica dos tecidos;

-Facilitar a subsequente coloração.


Assim sendo, o objetivo central desta etapa inicial do processamento do material histológico visa preservar sua estrutura de forma mais próxima possível daquela encontrada no tecido vivo, evitando ao máximo as distorções e possíveis perdas de materiais. Estes dois fenômenos, quando não são propriamente evitados, podem formar artefatos no corte do material.

O processo de fixação, em histologia é quase exclusivamente químico, onde substâncias (fixadores) são utilizadas com a principal função de insolubilizar as proteínas dos tecidos. Poderia ser também um processo físico, como por aquecimento ou resfriamento, mas não é de nosso interesse aqui detalharmos estes casos.

Os fixadores podem atuar como agentes desnaturantes ou como estabilizadores, formando pontes com as moléculas vizinhas. Deste modo, a solução isotônica tamponada de aldeído fórmico ou formaldeído a 4% consiste no fixador mais utilizado para a microscopia de luz, sendo conhecido como fixador universal. Juntamente com o aldeído glutárico (ou glutaraldeído), este utilizado principalmente para a microscopia eletrônica, o formaldeído reage com grupamentos amina (NH2), mas a química completa destas reações de fixação ainda não está bem elucidada.

Para evitar a ocorrência de artefatos no preparo do material, devem-se seguir os dois princípios básicos abaixo, tentando garantir que a fixação seja realizada de maneira eficiente:


- O material coletado deve ser imerso o mais rapidamente possível na solução fixadora;

- O volume de fixador deverá ser no mínimo 10 vezes maior que o volume da amostra tecidual coletada.


Objetivando-se conseguir um fixador ideal para cada tipo de tecido, os histologistas costumam elaborar diversas misturas fixadoras como, por exemplo, o líquido de Bouin (formaldeído, ácido acético e ácido pícrico).

O tempo de fixação varia de acordo com o tamanho da peça, constituição do tecido, poder de fixação do fixador, objetivos a pesquisar e temperatura ambiente. No entanto, de forma geral, caso o fragmento tenha uma espessura de cerca de 4 mm, o tempo mínimo de fixação é de doze horas.

No caso de fragmentos ósseos ou tecidos com áreas de calcificação, deve-se além de fixá-los, proceder à descalcificação ou desmineralização, que consiste na remoção dos sais de cálcio que se encontram depositado nos tecidos orgânicos sem alteração da sua estrutura celular, de modo a permitir que os cortes sejam realizados no micrótomo.

Esta etapa é importante, porque as navalhas utilizadas na etapa de microtomia, como a navalha de aço, para os blocos de parafina, e a navalha de vidro, para os blocos de resina acrílica, são bastante delicadas, e perdem o corte facilmente. Assim, os ossos ou outros materiais calcificados devem ser cortados em pequenos pedaços (cerca de 4mm) com serra adequada, antes da fixação. Depois de completada a fixação, o fragmento deve ser imerso na solução descalcificadora. Geralmente são empregados como agentes descalcificadores os ácidos nítrico, fórmico, tricloacético, clorídrico, pícrico e sulfossalicílico.

Não existe uma solução descalcificadora ideal. O ácido usado deve ser completamente removido do tecido depois de terminada a descalcificação, por meio de lavagem abundante e cuidadosa em água corrente ou álcool, de acordo com o agente descalcificador empregado. Os tempos de lavagem devem ser verificados de acordo com o protocolo utilizado.

Com a finalidade de permitir que a luz do microscópio atravesse o material, cortes muito delgados de tecido têm que ser feitos, de espessura de micrômetros. Infelizmente, embora o processo de fixação endureça o tecido, o material não se torna suficientemente firme ou coeso para sozinho permitir cortes delgados perfeitos.

Para que esse grau de firmeza seja atingido, o tecido deve ser completamente impregnado com algum meio de sustentação que manterá juntas as células e as estruturas intercelulares. Os materiais de sustentação usados são denominados materiais de inclusão.

Certos materiais de inclusão, como a gelatina, são solúveis em água, e assim os tecidos não precisam ser desidratados antes do uso. No entanto, os materiais mais comumente usados são substâncias semelhantes à parafina, que não são miscíveis com água.

Quando estes materiais de inclusão forem utilizados os tecidos obrigatoriamente deverão ser desidratados antes da inclusão. Resinas acrílicas (plásticas) também são utilizadas como meios de inclusão, mas aqui abordaremos principalmente o uso da parafina.