Metodologias com uso de Biologia Molecular: PCR

Farmácia

13/02/2013

Reação em cadeia da polimerase (PCR e RT-PCR)

A metodologia da reação em cadeia pela polimerase (PCR- “polymerase chain reaction”) permite obter a quantidade suficiente para se detectar e analisar qualquer sequência específica de DNA em estudo.

Com essa metodologia qualquer sequência específica de DNA poderá ser amplificada a partir de diversos materiais biológicos como sangue, urina, cabelo e biópsias de tecidos.

No entanto, a molécula de DNA deverá ser extraída do material coletado utilizando proteínas desproteinizantes como o fenol, clorofórmio, capazes de desnaturar e retirar as proteínas que ficam associadas à molécula de DNA no interior do núcleo.

Posteriormente, o etanol é adicionado permitindo que o material genético se precipite no tubo e por fim, possa ser solubilizado utilizando solução de tampão apropriada.

Conceito

A PCR, desenvolvida pelo geneticista Kary Mullis em 1993, utiliza a enzima Taq- polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus, que atua em elevadas temperaturas e baseia-se no processo de replicação do DNA que ocorre in vivo. Desta forma, para se entender melhor esta metodologia, primeiramente se faz necessário, relembrar alguns conceitos básicos de biologia.

O DNA é uma molécula de fita dupla formada por quatro nucleotídeos básicos: guanina (G), citosina (C), timina (T) e adenina (A); sendo que a guanina interage com a citosina e a timina com a adenina. In vivo, para que haja a replicação do DNA, essa molécula deverá se separar de forma a permitir que nucleotídeos novos emparelhem com cada uma das fitas de DNA separadas.

A ligação destes novos nucleotídeos e a formação de duas novas fitas de DNA ocorrerá a partir da presença de um conjunto de enzimas existentes no núcleo dos diferentes tipos celulares e que são importantes em cada etapa da replicação do DNA.

Assim como ocorre in vivo, a PCR também permite a formação de novas fitas de DNA. Neste caso, sequências específicas de DNA se amplificam em aproximadamente 1 Kb de comprimento através da repetição dos chamados ciclos de DNA.

Descrição da técnica

A PCR envolve ciclos múltiplos de um processo que pode ser dividido nas seguintes etapas:

1) denaturação, que significa separação da fita dupla de DNA em duas fitas únicas;

2) anelamento de oligonucleotídeos do tipo primers à seqüência molde de DNA;

3) extensão do primer ao longo da seqüência alvo de DNA;

4) formação de novas fitas duplas de DNA.

1) Denaturação:

A separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples ocorre quando se eleva a temperatura da amostra de DNA para 95º a 100ºC.

2) Anelamento dos primers:

O primer constitui em uma pequena sequência de ácido nucléico que se liga à fita de DNA alvo. Ele serve como ponto de partida para adição (extensão) de nucleotídeos (A, G, C ,T) complementares ao longo do resto da fita molde de DNA.

Na PCR, é necessário que se tenha um conhecimento prévio da sequência do DNA que se deseja amplificar que é denominada sequência alvo. A partir disso, desenham-se dois primers, ou seja, duas sequências iniciadoras que serão capazes de começar o processo de síntese da sequência alvo, ou seja, uma que servirá para promover a síntese da sequência alvo em um sentido da fita de DNA (3’-5’) e outro para o sentido inverso (5’-3’).

O anelamento dos primers, ou seja, a ligação dos primers à sequência alvo ocorrerá quando a temperatura for diminuída para aproximadamente 40º a 60ºC.

3) Extensão do primer ao longo da sequência alvo de DNA:

A extensão do primer ao longo da sequência alvo de DNA ocorrerá através da adição de nucleotídeos com o uso da polimerase estável ao calor (Taq- polimerase). Neste caso, a temperatura deverá ser elevada para 70º a 75ºC.

4) Formação de novas fitas duplas de DNA:

O procedimento inteiro incluindo as quatro etapas do ciclo de DNA pode ser realizado com um tubo de plástico de microcentrifuga contendo uma reação com uma mistura de tampões, nucleotídeos, primers, Taq- polimerase e uma amostra de DNA molde.

Através da PCR, uma única molécula de DNA poderá se multiplicar em mais de um bilhão de cópias após 30 ciclos em menos de três horas, dependendo do tempo aplicado para cada passo no ciclo e do tipo de termociclador usado.

O produto amplificado poderá ser visualizado através de um gel de eletroforese corado com brometo de etídeo e o seu tamanho poderá ser estimado comparando com padrões lineares de DNA.

As principais vantagens da PCR são ser simples e rápida e a necessidade quantidades pequenas de DNA alvo. Desta forma, a PCR constitui uma das mais poderosas ferramentas da biologia molecular atualmente sendo cada vez mais utilizada pelos pesquisadores e em laboratórios clínicos, além de poder ser utilizada para vários fins.

No entanto, suas principais limitações constituem na reprodutividade relativamente baixa no padrão das bandas eletroforéticas e no problema da contaminação do DNA por outro material genético que não aquele que se

Exemplos da utilização da PCR

A PCR pode ser usada não só para amplificar sequências de moléculas de DNA, mas também permite detectar mutações em uma sequência alvo, ou mesmo detectar moléculas de DNA de organismos que não são fáceis de serem cultivados. Além disso, através desta técnica se é possível realizar comparações genotípicas entre linhagens de diferentes organismos.

Por outro lado, a PCR constitui uma das técnicas mais usadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas para diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas, testes de paternidade e na medicina forense e criação de organismos transgênicos.

B) RT-PCR

A descrição técnica da RT-PCR é a mesma que a de PCR mostrado acima, uma vez que a RT-PCR constitui uma variação da PCR. Desta forma, para a sua realização, se faz necessária a utilização de uma enzima denominada transcriptase reversa, previamente ao uso da polimerase.

A transcriptase reversa é uma enzima capaz de realizar uma transcrição ao contrário, ou seja, capaz de polimerizar moléculas de DNA a partir de moléculas de RNAm (RNA mensageiro) e é encontrada naturalmente em vírus como o HIV.

O isolamento da transcriptase reversa permitiu que houvesse adaptação da PCR e assim, moléculas de RNA são convertidas para moléculas de DNA, denominadas de cDNA. Elas recebem este nome por ser uma fita de DNA complementar ao RNA, sendo que, a partir da síntese do cDNA.

Exemplos da utilização da RT-PCR

A técnica de RT- PCR permite estudar a expressão de um gene específico, pois só haverá cDNA para ser amplificado, se tiver existido um RNAm que corresponde, portanto, à expressão do gene responsável pela transcrição deste RNAm.

A expressão para a produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da célula dentro do organismo do hospedeiro, como por exemplo, células musculares expressam proteínas diferentes das células cardíacas. Além disso, existem vários artigos na literatura especializada mostrando adaptações desta técnica para os mais diversos objetivos e a partir de diferentes amostras como plantas e outros animais como porcos.