Análise Fitoquímica

Farmácia

14/05/2014

As plantas têm sido uma rica fonte para obtenção de moléculas para serem exploradas terapeuticamente. Muitas substâncias isoladas de plantas continuam sendo fontes de medicamentos e o interesse da pesquisa nesta área tem aumentado nos últimos anos.

Dentre os fatores que têm contribuído para um aumento nas pesquisas está a comprovada eficácia de substâncias originadas de espécies vegetais e por muitas plantas serem matéria-prima para a síntese de fármacos.

A pesquisa fitoquímica busca conhecer os constituintes químicos das plantas ou conhecer o grupo de metabólitos secundários relevantes nas mesmas.

Quando não se dispõe de estudos químicos sobre as espécies de interesse, a análise fitoquímica preliminar pode indicar o grupo de metabólitos secundário relevante da mesma. Caso o interesse esteja restrito a uma classe específica de constituintes ou às substâncias responsáveis por certa atividade biológica, a investigação deverá ser direcionada para o isolamento e a elucidação estrutural da mesma

Os estudos fitoquímicos abrangem a pesquisa de vegetais, e não apenas de plantas medicinais, para obtenção ou desenvolvimento de medicamentos, ou seja, como fonte de matéria-prima farmacêutica, a descoberta de substâncias ativas de plantas como protótipo de fármacos, bem como o desenvolvimento de fitoterápicos.

As análises fitoquímicas fornecem informações relevantes da presença de metabólitos secundários nas plantas, para que assim possa chegar ao isolamento de princípios ativos importantes na produção de novos fitoterápicos.

É uma área multidisciplinar, e tem como objetivo a extração, isolamento, purificação e elucidação estrutural dos constituintes presentes em plantas, e que apresentam atividade biológica. Entre as classes de princípios ativos vegetais podemos citar os metabólitos secundários: alcalóides, cumarinas, esteróides, flavonóides, glicosídeos cardioativos, lignanas, óleos essenciais, saponinas, triterpenos, entre outros.

Características gerais dos produtos do metabolismo secundário:

- Abundância muito baixa (inferior a 1% do C total).
- A estocagem ocorre em uma célula ou tecido específico.
- Distribuídos esparsamente nos reinos animal e vegetal, neste caso muitas vezes específico para uma espécie de plantas.
- Apresentam uma gama de atividades biológicas nas plantas as quais os produzem.

O Estudo de produtos naturais (PN) bioativos deve ser feito necessariamente em equipes multidisciplinares. O sucesso do estudo dependerá do conhecimento e compreensão que cada um dos membros da equipe tem dos objetivos e suas etapas. Deve-se evitar super valorização do uso e necessidade de equipamentos Sofisticados, já que, muitas vezes, consegue-se isolamento com técnicas mais simples e baratas.

Alguns pontos devem estar esclarecidos entre a equipe de pesquisadores:

1. Qual atividade biológica esperamos? Devemos usar um único ensaio ou mais de um para investigar a bioatividade de interesse?

2. Qual ou quais as técnicas de separação são mais para isolamento se pretendemos fazer a determinação estrutural e realização de testes biológicos em grande escala?

3. Quais são os requisitos mínimos para a elucidação estrutural do composto bioativo?

4. As informações obtidas na separação do composto(s) bioativo(s) de interesse podem ser relacionadas e integradas para o desenvolvimento de um método de detecção e análise dos componentes?

Duas questões são fundamentais quando se planeja uma metodologia de extração e isolamento de princípios ativos vegetais:

1. O que eu estou tentando isolar?

- um composto desconhecido responsável por uma atividade biológica em particular.
- um composto já conhecido produzido por um organismo em particular.
- um grupo de compostos dentro de um organismo, os quais estão todos Relacionados com uma mesma via metabólica possuindo, por exemplo, uma Estrutura básica comum.

2. Por que eu estou tentando isolar? As razões para uma extração podem ser:

- purificar uma quantidade suficiente do composto para caracterizá-lo parcialmente ou totalmente.
- fornecer uma quantidade suficiente do composto para permitir a confirmação ou exclusão de uma estrutura proposta.

O isolamento de produtos naturais com atividade biológica tem várias vantagens, entre elas podemos destacar:

Os compostos puros podem ser administrados em doses reprodutivas e precisas.
Eles podem levar ao desenvolvimento de métodos analíticos para o composto de interesse ou para uma classe de compostos em particular.
- A elucidação estrutural do composto bioativo pode fornecer as bases para:
- A produção sintética do composto.
- A modificação estrutural visando desenvolver análogos mais efetivos e com menor toxicidade.
- O estudo do mecanismo de ação do composto ativo.

Importância da identificação do material vegetal

A identificação segura do vegetal empregado no preparo de fitoterápicos garante o efeito terapêutico pretendido, pois este está relacionado com as propriedades farmacodinâmicas da droga indicada, característica de uma determinada espécie. No caso de uma identificação positiva, também o grau de pureza da droga deve ser controlado, avaliando-se não só os princípios ativos como também as possíveis adulterações, falsificações e impurezas. No âmbito de pesquisa em fitoquímica, a identificação positiva e segura da do material vegetal sob investigação garante a padronização dos métodos e a reprodutibilidade dos resultados, os quais podem vir a ter aplicação prática.

Deve-se, ainda, atentar para o fato de que uma mesma espécie botânica pode possuir diferentes nomes populares ou, ao contrário, diferentes espécies botânicas com um mesmo nome popular, segundo a região ou população que as usa.

Portanto, é essencial que se prepare uma exsicata para a identificação botânica e que a seleção do material coletado seja feita adequadamente, evitando coletar partes do vegetal afetadas por doenças, parasitas e também materiais estranhos, tais como outras plantas ou mesmo partes da própria planta que não sejam de interesse para a investigação. Parte integrante de uma identificação precisa e segura do material a ser utilizado na pesquisa fitoquímica, a determinação da época da coleta e da procedência do material pode evitar divergências na sua análise química, condicionada à sazonalidade e às condições do solo e do ar onde o vegetal cresce. A planta escolhida deve ser seguramente identificada por um botânico ou um técnico especializado.

Ao coletar-se uma planta para análise botânica deve-se coletar o material o mais completo possível, com pelo menos um ramo florido com 20 a 30 cm de altura. O material vegetal coletado deve ser distendido e colocado entre folhas de papel absorvente - papel jornal, por exemplo - o conjunto deve ser então acondicionado entre placas de papelão para ser em seguida prensado. A prensa deve ser firmemente amarrada com cordas. A secagem deve acontecer em estufa a 37ºC por um ou dois dias ou à temperatura ambiente, por um tempo mais longo. Material suculento necessita de mais tempo para secagem.

As seguintes informações devem constar em uma etiqueta que acompanha a exsicata: Nome da Instituição, Número da Amostra e Data da Coleta; Classificação Botânica; Família, Nome Científico (espécie) e Nome Popular; Procedência, Observações, Nome do Coletor e Nome do Especialista que identificou.

Preparação do material vegetal (MV)

A utilização de MV fresco pode ser indispensável para a detecção de alguns componentes específicos. Seu emprego traz a vantagem de evitar a presença de substancias oriundas do metabolismo de fenecimento do vegetal. Caso não seja utilizado imediatamente, o MV deve ser processado ou conservado, até a análise posterior.

O emprego de MV seco é bastante interessante, devido a sua maior estabilidade química, porém exige cuidados a fim de interromper os processos metabólicos que ocorrem após coleta da planta.

Estabilização e secagem

A estabilização do MV impede a atividade enzimática e, assim, evita a alteração dos compostos químicos originalmente presentes no vegetal. Consiste na desnaturação protéica das enzimas celulares, através da destruição das suas estruturas quaternária e terciária, seja pela ação de agentes desidratantes, tais como etanol, ou por ação do calor. Imersão do MV em etanol em ebulição ou por operação de secagem em alta temperatura (acima de 60ºC) e curto tempo de exposição (15 a 30 min).

A secagem tem por finalidade a retirada de água e com isso, impedir reações de hidrolise e crescimento microbiano. A umidade residual dependera do tipo de órgão que constitui o MV. Propicia a redução de volume e de peso e facilita a moagem dos materiais.

Caracteriza-se pela exposição a temperaturas relativamente baixas, inferiores a 60ºC, e longo tempo de exposição, em torno de 7 dias.

A secagem será tanto mais rápida quanto mais dividido estiver o MV, devido a maior superfície de evaporação. Pelo mesmo motivo, o MV devera ser disposto em camadas finas. Pode ser realizada ao ar livre ou em estufas.

Ar livre: mais econômica, mas exige maior vigilância para garantir a uniformidade das condições durante a operação. Preferencialmente a sombra, já que a irradiação solar pode alterar a constituição química do material. Local seco e livre de insetos ou contaminantes ambientais. Dispor o MV sobre papel para absorção da umidade.

Estufas: temperatura constante durante o processo. Ar circulante para evitar a saturação com vapor d’água que vai sendo desprendido do material a secar.

Moagem

Tem por finalidade reduzir, mecanicamente, o MV a fragmentos de pequenas dimensões, preparando-o para a extração. O aumento da área de contato entre o MV solido e o liquido extrator torna mais eficiente a operação. A escolha das dimensões mais adequadas depende também da textura do órgão vegetal. Quanto mais rígidos os tecidos, maior será o grau de divisão necessário.

Divisão grosseira: seccionamento (tesouras, podões, facas), impacto (redução a fragmentos por meio de choques repetidos, em gral), rasuração (raspadores ou processadores de alimentos).

Pulverização: em gral, com opção de emprego de um intermédio para facilitar a pulverização. Em moinhos, de diversos tipos, escolhidos considerando três aspectos: principio de funcionamento, características do MV, como dureza, elasticidade e friabilidade, e as propriedades químicas dos constituintes de interesse. Ideal realizar a pulverização momentos antes da utilização do material vegetal.

Analise fitoquímica preliminar

Para algumas substancias, em certos vegetais, podem-se realizar reações de caracterização diretamente sobre os tecidos do MV. Entretanto, na maioria das vezes, para se proceder a caracterização de um determinado grupo de substancias presentes em um vegetal, deve-se primeiro extrair essas substancias com um solvente adequado, para então caracterizá-las no extrato.

Testes histoquímicos: permitem a caracterização de certos grupos de constituintes químicos. Baseia-se na adição de reativos específicos sobre a lâmina com uma secção de amostra, diretamente sobre o MV.


Reações químicas de caracterização: a caracterização dos principais grupos de metabólitos secundários de interesse tem sido conseguida pela realização de reações químicas que resultam no desenvolvimento de coloração ou precipitação.

Para algumas reações o extrato pode ser utilizado diretamente, para outras o solvente deve ser previamente removido.

Essas reações são realizadas em tubos de ensaio ou placas, podendo também ser utilizada a detecção cromatográfica com reagentes específicos.

A realização de reações de caracterização diretamente no extrato bruto pode eventualmente mascarar o resultado. O fracionamento do extrato e a realização dos testes nas frações obtidas possibilitam reações mais nítidas.

Os roteiros clássicos para análise sistemática de misturas complexas baseiam-se em dois princípios:

Partição de substâncias entre duas fases imiscíveis, uma aquosa e outra orgânica
Formação de sais com diferenças de solubilidade em relação as bases ou ácidos que lhes deram origem.

Baseiam-se nas propriedades químicas das substancias químicas presentes na droga vegetal. Algumas reações são consideradas especificas, no entanto são pouco eficazes como único método de identificação.

Principais reações:

Cumarinas: no extrato pode ser feita pela observação do mesmo sob luz UV 360nm, pois a maioria possui fluorescência azul-brilhante ou verde. Em solução alcalina desenvolvem cor amarela, devido ao rompimento do anel lactonico, que pode ser revertido pela adição de solução acida.
Polifenóis: são substancias redutoras e, portanto, oxidam-se com facilidade, resultado em substâncias coradas. Oxidantes como o cloreto férrico (FeCl3) são empregados para caracterizacao de polifenois. Positivo: coloração azul ou azul-esverdeada. Cada classe especifica de polifenois pode ser melhor caracterizada com reações especificas:

Flavonóides: teste da cianidina ou Shinoda (HCl concentrado e magnésio em pó). Para compostos com nucleo α-benzopirona, desenvolvimento de cor laranja a vermelha.

Taninos: reações tradicionais de precipitação com gelatina ou pó-de-pele, sais de alcalóides e metais pesados. Taninos hidrolisáveis e condensados são diferenciados pela reação de Stiasny (HCl concentrado e formol). Ocorrendo precipitação dos condensados. No sobrenadante pode-se detectar os hidrolisáveis com a reação com cloreto férrico, desenvolvimento de cor azul.

Antraquinonas: os derivados antraquinonicos ocorrem em vários níveis de oxidação e por isso o material deve ser tratado para que ocorra uma oxidação total destes ate antraquinonas, submetendo o ao aquecimento com mistura de KOH 0,5M e peróxido de hidrogênio diluído. Reação de Börntrager que detecta agliconas antraquinonas e, assim, anteriormente a reação, deve-se proceder a hidrolise.

Triterpenos e esteróides: reação de Liebermann-Burchard (anidrido acético-acido sulfúrico). Triterpenos desenvolvem coloração mutável com o tempo. Esteróides coloração estável. Reação de Salkowsky (acido sulfúrico concentrado) para esteróides insaturados.

Saponinas: teste de formação de espuma, estável na presença de ácidos minerais diluídos.

Glicosídeos cardiotônicos: reação de Kedde (solução etanolica do acido 3,5-dinitrobenzoico e KOH alcoólico) para detecção do núcleo esteroidal. Reação de Keller-Killiani (acido acético glacial cloreto férrico e acido sulfúrico concentrado) que detecta presença de lactona insaturada em C-17 e desóxi-acucares.

Extração

Antes de executar uma extração deve se levar em consideração uma serie de fatores que interferem na operação:

Características do MV: A estrutura histológica das diversas partes componentes de uma planta é bastante heterogênea; existem órgãos, como as raízes e caules, cujos tecidos são extremamente compactados (xilema), ao passo que em folhas e flores os tecidos se apresentam com textura mais delicada. Como o poder de penetração dos solventes depende , entre outros fatores, da consistência dos tecidos que formam o material a extrair, as características do MV influencia diretamente na eficiência de extração.

Grau de divisão do MV: Influencia diretamente a eficiência de extração. Quanto mais rígido o material a extrair, menor deve ser a granulometria do MV. No geral, o aumento da área superficial conseguida pela diminuição da granulometria do MV favorece uma extração mais eficiente.
O meio extrator (solvente): O solvente escolhido deve ser o mais seletivo possível, para conseguir extrair somente as substâncias desejadas ou em maior quantidade. Como a seletividade depende da polaridade, o conhecimento do grau de polaridade do grupo de substancias que se deseja preferencialmente extrair determina o solvente ou mistura de solventes seletivos para aquela extração.

Em análises fitoquímicas, quando não se conhece previamente o conteúdo do MV, costuma-se submeter o MV a sucessivas extrações, com solventes de polaridade crescente, conseguindo-se assim uma extração fracionada, em que as diferentes frações contem compostos de polaridade também crescente.

Tabela 1. Exemplos de solventes, em ordem crescente de polaridade e os respectivos grupos de metabolitos majoritariamente encontrados nos diferentes extratos.

A extração de determinadas substancias ainda pode ser influenciada pelo pH do liquido extrator. Ex: extração de alcalóides (substancias de natureza alcalina) com soluções ácidas.

No geral, praticamente todos os constituintes de interesse para análise fitoquímica apresentam alguma solubilidade em misturas hidroetanólicas ou metanólicas a 80%, de tal modo que estas costumam ser empregadas com freqüência.

Na escolha dos solventes, alem dos fatores relacionados com a eficiência do processo extrativo, devem ainda ser considerados a toxicidade e riscos que seu manuseio representa, a estabilidade das substâncias extraídas, a disponibilidade e custo do solvente.

Metodologia

Os fatores relacionados com a metodologia de extração dizem respeito a agitação, temperatura e ao tempo necessário para executá-los.

Considerando que os processos de extração dependem, em grande parte, de fenômenos de difusão e que a renovação do solvente em contato com as substancias a dissolver desempenha um papel de grande influencia na velocidade da dissolução, pode-se concluir que a agitação pode abreviar consideravelmente a duração de um processo extrativo.

O aumento na temperatura provoca um aumento da solubilidade de qualquer substância, motivo pelos quais os métodos de extração a quente são sempre mais rápidos do que aqueles realizados a temperatura ambiente. Entretanto o calor nem sempre pode ser empregado, já que muitas substâncias são instáveis em altas temperaturas.

Na escolha do método de extração, deve-se avaliar: a eficiência, a estabilidade das substancias extraídas, a disponibilidade e o custo do processo escolhido, considerando a finalidade do extrato que se quer preparar.

Deve-se ainda definir, com maior precisão possível, o que se deseja obter, já que a composição química dos MVs é extremamente complexa e ocorre a extração concomitante de vários tipos de substâncias, farmacologicamente ativas ou não, desejadas ou não.

Assim, levando-se em consideração os fatores envolvidos no processo extrativo, pode-se escolher o método e o solvente que serão empregados.

Métodos de extração sólido líquido

Extrações a frio

Turbolização: A redução drástica do tamanho das partículas e o conseqüente rompimento das células favorecem a rápida dissolução das substâncias ativas, resultando em tempos de extração de minutos e quase esgotamento da droga. Os equipamentos turboextratores estão disponíveis em diversos tamanhos e em laboratório, para pequenas quantidades, utiliza-se o liquidificador, sempre atentando para a estabilidade da solução extrativa. Alem da eficiência do método, somam-se a simplicidade, rapidez e versatilidade, que permitem a fácil utilização dessa técnica em processamentos de pequena e media escala. Inconvenientes: difícil separação da solução extrativa por filtração, geração de calor durante o procedimento, que obriga a controlar a temperatura, restringindo o emprego de líquidos voláteis e a limitação da técnica, quando se trata de caules, raízes ou materiais de elevada dureza.

Maceração: A extração do MV se da em recipiente fechado, em temperatura ambiente, durante período prolongado (horas ou dias), sob agitação ocasional e sem renovação do liquido extrator. Não conduz ao esgotamento do MV, seja devido a saturação do liquido extrator ou ao estabelecimento de um equilíbrio difusional entre o meio extrator e o interior da célula. Principais fatores que influenciam o processo: MV (quantidade, natureza, teor de umidade, tamanho de partícula, capacidade de intumescimento); Líquido extrator (seletividade, quantidade); Sistema (proporção droga: liquido extrator, temperatura, agitação, pH, tempo de extração). Preferencialmente para MV ricos em substancias ativas e que não apresentam uma estrutura celular, como goma, resinas e alginatos. Utilizada para preparação de tinturas em homeopatia, tinturas oficinais. Líquidos extratores preferenciais são o etanol e misturas hidroetanólicas. Não se recomenda a utilização de misturas hidroetanólicas inferiores a 20%, para evitar proliferação microbiana. Líquidos muito voláteis são raramente utilizados.

Percolação: Tem como característica a extração exaustiva das substancias ativas. O MV moído é colocado em recipiente cônico ou cilíndrico (percolador), de vidro ou de metal, através do qual é feito passar o liquido extrator. O produto obtido denomina-se percolado. É uma operação dinâmica, indicada na extração de substâncias farmacologicamente muito ativas, presentes em pequenas quantidades ou pouco solúveis e quando o preço da droga é relevante.

Extrações em sistemas abertos

Infusão: A extração do MV utilizando como solvente água fervente, durante certo tempo, e recipiente tapado. É aplicável a partes de vegetais de estrutura mole, as quais devem ser contundidas, cortadas ou pulverizadas grosseiramente para facilitar a extração.

Turbolização: Ver acima.

Decocção: Consiste em manter o MV em contato, durante certo tempo, com um solvente (normalmente água) em ebulição. Tem emprego restrito, pois muitas substâncias ativas são alteradas por aquecimento prolongado. Costuma-se empregar para MV duros e de natureza lenhosa.

Extrações a quente em sistemas fechados

Extração sob refluxo: Consiste em submeter o MV a extração com um solvente em ebulição, acoplado a um condensador, de forma que o solvente evaporado durante o processo seja recuperado e retorne ao conjunto. Precauções com a termolabilidade de algumas substâncias devem ser observadas.

Extração em aparelho de Soxhlet: Útil para extrair sólidos com solventes voláteis, empregando o aparelho de Soxhlet. Em cada ciclo o MV entra em contato com solvente renovado, assim possibilita uma extração altamente eficiente, empregando uma quantidade reduzida de solvente, em comparação com outros processos extrativos.

Fracionamento, isolamento e purificação de substâncias

Fracionamento

Para o fracionamento pode-se utilizar diferentes técnicas:

- a partição líquido – líquido, que explora a imiscibilidade de alguns solventes orgânicos com água;
- a partição ácido-base
- a cromatografia de coluna, às vezes sob pressão (freqüentemente dispensável), que está fundamentada na capacidade de um eluente (uma mistura de solventes em proporções definidas) de deslocar, arrastando sucessivamente, substâncias, que se adsorvem ao suporte inerte segundo suas polaridades.

A partição líquido-líquido é bastante utilizada para fracionamento de extratos vegetais e implica uma dissolução seletiva e distribuição entre as fases de dois solventes imiscíveis, visando uma separação (semipurificação) das substâncias através de suas polaridades. A eficiência da extração entre as fases depende da afinidade do soluto pelo solvente de extração, da razão das fases e do número de extrações. Os melhores rendimentos são obtidos quando o volume total de solvente a ser utilizado na partição é dividido em alíquotas. A concentração de cada um dos componentes em cada fase esta relacionada com o coeficiente de partição ou distribuição apresentado por cada substância.

Melhores rendimentos são obtidos quando o volume total de solvente a ser utilizado na partição é dividido em alíquotas. Esse fracionamento por partição, que é um método de extração liquido/liquido, é realizado em funil de separação.

Já a partição ácido-base acontece por formação de sais com diferenças na solubilidade em relação as bases ou ácidos que lhes deram origem, podendo separar os sais da substancia de interesse em certas condições. Ex: extração de alcalóides, onde se obtém uma mistura bruta doa alcalóides totais da droga vegetal que posteriormente pode passar por procedimentos de isolamento e identificação estrutural de cada alcalóides em particular.

A cromatografia de coluna de uma mistura complexa de substâncias químicas pode fornecer, em etapas iniciais, frações semipurificadas, que separadamente podem ser analisadas quanto a sua constituição química e atividade biológica. Então, somente as frações de interesse são submetidas a técnicas de isolamento e identificação.

Uma vez que se obtêm frações semipurificadas, os métodos de partição eliminam uma grande parte do material indesejado.

O fracionamento de extratos vegetais com objetivos de isolamento de substâncias químicas pode ser monitorado:

Por ensaios direcionados para avaliação da atividade biológica

Monitoramento das frações por cromatografia (CCD, CLAE/UV, CLAE/EM, CLAE/RMN)

A utilização da cromatografia possibilita direcionar as operações de fracionamento para o isolamento dos compostos considerados de maior interesse em função dos dados obtidos.

Pode-se iniciar o fracionamento de um extrato vegetal através da partição por solventes orgânicos de polaridade crescente ou através de partição ácido-base.

A partição implica uma dissolução seletiva e distribuição entre as fases de dois solventes imiscíveis, podendo ser aplicado para separação de componentes de uma mistura. A concentração de cada um dos componentes em cada fase esta relacionada com o coeficiente de partição ou distribuição apresentado por cada substancia.

Melhores rendimentos são obtidos quando o volume total de solvente a ser utilizado na particao é dividido em alíquotas. Esse fracionamento por partição, que é um método de extração liquido/liquido, é realizado em funil de separação.

Já a partição ácido-base acontece por formação de sais com diferenças na solubilidade em relação as bases ou ácidos que lhes deram origem, podendo separar os sais da substancia de interesse em certas condições.

Separação e isolamento (métodos cromatográficos)

Basicamente, a metodologia mais amplamente utilizada para isolamento de metabolitos secundários é a seguinte:

O extrato selecionado deverá ser submetido à diferentes técnicas cromatográficas. A princípio, é geralmente empregada a cromatografia em coluna aberta (CC), com sílica gel como fase estacionária, onde, dependendo do extrato, a mesma é eluída com uma mistura de solventes que deve ser previamente determinada por cromatografia em camada delgada (CCD). Outros suportes cromatográficos podem ser usados, como alumina, celulose, poliamida e sephadex®. As frações obtidas devem ser reunidas segundo seu perfil cromatográfico, verificado por CCD. Em muitos casos, se obtém compostos puros numa única CC, ou utilizando a cromatografia “flash”60 ou ainda após uma simples recristalização da substância isolada. As frações reunidas, se ainda não estiverem puras, devem ser novamente submetidas à CC ou, dependendo da complexidade da mistura, à técnicas cromatográficas especiais, como cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia de contra-corrente (CCC), etc.

Portanto, os métodos cromatográficos são os procedimentos de separação e isolamento mais amplamente utilizados. Servem, também, para fins de identificação e análise de misturas e de substâncias isoladas (cromatografia analítica) além de isolamento de compostos (cromatografia preparativa).

Uma vez isolados os compostos ativos, deve-se proceder a elucidação estrutural dos mesmos. Uma ferramenta que seria importante para a identificação rápida e eficiente de misturas, consiste no uso de cromatografia gasosa ou cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massa, onde grande parte dos componentes de uma mistura pode ser identificada e quantificada.

Cromatografia

A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel (FM) e a fase estacionária (FE). A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. A FE pode encontrar-se empacotada em coluna (aberta ou fechada) ou constituir uma superfície plana, como na cromatografia em papel ou CCD.

A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura.

Cromatografia líquida

A cromatografia líquida em coluna é uma das técnicas mais utilizadas para separação ou isolamento de constituintes de extratos vegetais. É bastante versátil, uma vez que se podem utilizar colunas de diferentes tipos e dimensões. Pode ser realizada em colunas de vidro, sob pressão atmosférica, mas também utilizando equipamentos específicos que permitem trabalhar com pressões maiores, aumentando a velocidade e a eficiência do processo de separação.

A cromatografia líquida em coluna apresenta uma importante subdivisão: a cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade, e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na qual se utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel.

A cromatografia liquida divide-se em quatro modalidades, de acordo com o processo no qual se baseia a separação dos componentes da mistura a ser analisada:

Cromatografia de partição: Separação com base nos coeficientes de partição entre dois solventes imiscíveis que constituem as fases: móvel e estacionária.

Cromatografia de adsorção: Adsorção dos componentes de uma solução sobre a FE solida constituída por partículas finas de adsorventes polares ou apolares. O componente que for mais fortemente atraído pelo adsorvente será deslocado pela FM de forma mais lenta.

Cromatografia de troca iônica: Aplicada na separação de substancias contendo grupos ionizáveis, como aminoácidos, alcalóides. Baseia-se no intercambio de íons entre FM e resinas contendo grupos funcionais do tipo sulfônico ou amônio quaternário.

Cromatografia de exclusão ou de filtração molecular: Baseia-se no tamanho das moléculas do soluto que passa através da FE, constituída por um gel poroso. As moléculas maiores não conseguem penetrar nos poros e são arrastadas pela FM, enquanto as moléculas de menor tamanho, capazes de entrar nos poros da FE são retidas por mais tempo no interior da coluna. Utilizam-se géis derivados do dextrano (ex: Sephadex®).

Nessas categorias acima se enquadram as várias técnicas de cromatografia líquida que se diferenciam entre si pelos equipamentos e também pelo tipo de material usado como fase estacionária.

Cromatografia em Coluna – Cromatografia líquida clássica

Esta técnica é muito utilizada para isolamento de produtos naturais. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida. Fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionárias líquidas por partição. Suportes quimicamente modificados também têm sido usados, sendo o processo de separação misto neste caso.

Esses suportes são acondicionados em tubos cilíndricos geralmente de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior.

Os adsorventes possuem partículas na faixa de 60-230 mesh, de modo a possibilitar um fluxo razoável do solvente através da coluna. O uso de sílica de partícula menor (230-400 mesh) como adsorvente para essas colunas requer a utilização de um sistema de bombeamento para o empacotamento e eluição, sendo conhecido como Cromatografia Flash.

A principal etapa ao se utilizar essa técnica é o empacotamento, o qual, entre outros fatores, definirá a eficiência da separação. Enquanto a alumina é empacotada em sua forma original, a sílica deve sê-lo na forma de suspensão.

À coluna adiciona-se uma pequena quantidade de solvente e deposita-se na sua extremidade inferior um chumaço de algodão com espessura de aproximadamente 0,5 cm para impedir a passagem de partículas da fase estacionária. A adição de sílica deve ser feita com a torneira semi-aberta. O adsorvente é adicionado lentamente à coluna fixada na posição vertical, batendo-se continuamente ao longo da mesma para que todo o ar seja expulso, de modo a se obter uma compactação uniforme. A existência de ar entre as partículas leva à formação de canais na coluna, os quais alargam as bandas eluídas.

Nunca se deve permitir que o nível do solvente desça abaixo do nível do adsorvente, o que poderia acarretar rachaduras, comprometendo a eficiência da coluna.

Após o empacotamento é conveniente que se passe certa quantidade do eluente (duas a três vezes o volume da coluna) a ser utilizado através da coluna antes da introdução da amostra. Esta é adicionada à coluna com o auxílio de uma pipeta no momento em que o nível do eluente esteja o mais próximo possível do adsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas a serem eluídas. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente é então adicionado cuidadosa e continuamente.

A escolha do eluente segue os princípios discutidos em CCD, mas neste caso ele pode ser mudado durante o processo cromatográfico. Se, por exemplo, a amostra é constituída por duas substâncias, uma apolar e outra polar, utiliza-se primeiramente um eluente apolar e em seguida um eluente polar.

O volume das frações a serem recolhidas é função da quantidade de amostra e do grau de dificuldade da separação. Para análise das mesmas, recorre-se a alguma técnica auxiliar, usualmente CCD.

Em vista de que geralmente algumas partículas da amostra permanecem irreversivelmente adsorvidas à fase estacionária, a cada separação é necessário um tratamento para a recuperação do adsorvente.

Cromatografia em coluna - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A CLAE utiliza colunas contendo FE de partículas extremamente finas (µm), esféricas ou irregulares, homogêneas e densamente compactadas e requer uma alta pressão e fluxo livre de pulsação para que a FM flua a uma velocidade razoável através da coluna, o que torna a técnica mais cara. É possível trabalhar com pressões inferiores, em equipamentos mais simples, como na cromatografia líquida a vácuo ou ainda cromatografia líquida de média pressão.

FE mais comumente utilizadas:

- Substâncias inorgânicas como géis de sílica e alumina (óxido de alumínio): compostos lipofílicos

- Materiais orgânicos como celulose, poliamida e géis de dextrano: substâncias hidrofílicas como aminoácidos e açúcares.

- Materiais modificados quimicamente, como a celulose acetilada ou gel de sílica substituídos por cadeias alifáticas de C8 a C18.

As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.

A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado.

As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a coluna. Existem alças de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alças na faixa de 5-50 mL para injeções analíticas e 0,5-2 mL para preparativas.

As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável, com diâmetro interno de cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação.

O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta simples ou DAD, sendo também empregados detectores de fluorescência, de índice de refração, e eletroquímicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE diferenciam compostos quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente à luz plano-polarizada.

O registro de dados pode ser feito através de um registrador, um integrador ou um microcomputador. A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência.

Tem sido utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, ferormônios, no isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicações.

As separações em CLAE podem ser por adsorção, partição ou ambos. O suporte mais comumente utilizado é a sílica. O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas a um suporte não tem grande aplicação devido à perda de fase estacionária, mas o uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqüência do problema acima, possibilita a produção de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas são chamadas de quimicamente ligadas.

Essas fases, dependendo da modificação feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, e em fase reversa, a fase móvel é mais polar.

Separações analíticas são predominantemente realizadas em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecilsílica) a mais usada, ao passo que são preferidas fases que atuem no modo normal para fins preparativos. Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque deve ser dado às fases estacionárias quirais, as quais possibilitam a separação direta de enantiômeros. Para tanto, é necessária a presença de um seletor quiral como parte integrante da fase estacionária.

Cromatografia líquida - Cromatografia em contra-corrente (CCC)

É uma técnica de cromatografia de partição líquido-líquido, cuja fase estacionária está retida no aparelho pela força gravitacional ou pela força centrífuga sem a utilização de uma matriz porosa adsortiva, um dos líquidos fica parado e o outro segue movendo-se. A distribuição do soluto em cada uma das fases é determinada através de seus respectivos coeficientes de partição entre dois líquidos imiscíveis, ou seja, que não se misturam. Essa técnica é amplamente utilizada no fracionamento de extratos vegetais pela eficiência na separação de várias classes de produtos naturais. A ausência de fase estacionaria solida elimina certas inconveniências, como a interação da amostra com a matriz acarretando perda de material. Essa técnica cromatográfica é muito versátil por apresentar uma ampla faixa de separação (Kd = 0,2 a 3,5), além de ser utilizada na separação de substâncias de baixa a alta polaridade. É uma técnica preparativa, possibilitando a utilização de grande quantidade de amostra (na escala de miligramas a gramas de material e mais modernamente, na escala de kilogramas) sem a necessidade de pré-purificações. É uma técnica econômica, pois o consumo de solventes orgânicos – tóxicos para quem os manipula – é baixo.

Cromatografia planar - Cromatografia em Camada Delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.

Por ser um método simples, rápido, visual e econômico, a CCD é a técnica predominantemente escolhida para a identificação de frações coletadas em cromatografia líquida clássica, sendo também muito utilizada para a purificação de substâncias.

A CCD é amplamente utilizada para análise, tanto de extratos vegetais brutos quanto para avaliar o resultado de um processo de separação. Eventualmente pode ser utilizada com fins preparativos, usando suportes de maior espessura, que comportam quantidade maior de amostra. Podem-se escolher diversos suportes, tanto de fase normal como reversa, dependendo da polaridade dos componentes da amostra.

As placas de CCD podem ser confeccionadas no próprio laboratório, através de um dispositivo que facilita o espalhamento uniforme sobre as placas de vidro, da suspensão aquosa do suporte. É bastante econômico, mas requer certa pratica, pode ser muito satisfatório em certas análises de rotina, utilizando suportes comuns como gel de sílica.

Há disponível grande variedade de placas cromatográficas preparadas industrialmente, padronizadas quanto ao tamanho de partículas do suporte, a espessura da camada a ativação do suporte, possibilitando resultados mais reprodutíveis do que com as placas preparadas manualmente. Podem conter indicadores fluorescentes em 254 nm (F254), sobre placa de vidro, celulóide ou alumínio. As placas de celulóide e alumínio alem de inquebráveis possibilitam que se recortem as placas em tamanho menor, se desejado.

O desenvolvimento da CCD ocorre em cuba fechada, saturada com FM. A aplicação da amostra é feita a partir de soluções relativamente concentradas, com capilares, a uma distancia adequada das bordas laterais e inferior, bem como das demais amostras. A placa é deixada na cuba, onde o solvente irá subir por capilaridade, até que ele esteja a aproximadamente 2 cm da extremidade superior. Ao ascender, o solvente irá arrastar mais os compostos menos adsorvidos na fase estacionária, separando-os dos mais adsorvidos. A linha de chegada da fase móvel deve ser marcada e a placa deve estar seca. Como a maioria dos compostos orgânicos é incolor, faz-se necessária a utilização de um processo de revelação para que se possa analisar o resultado.

O parâmetro mais importante a ser considerado em CCD é o fator de retenção (Rf), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel.

Na CCD preparativa pode-se utilizar maior numero de placas com a mesma amostra, que é aplicada em linha ou barra.

A seleção da fase móvel, que geralmente é constituída por um ou mais solventes, não é tarefa simples. No entanto, uma vez que as fases estacionárias mais usadas são extremamente polares, não devem ser utilizados solventes pouco polares, que não removeriam os compostos do ponto de aplicação, nem solventes muito polares, capazes de arrastar os componentes da amostra até o topo da placa. Em vista disso, melhores resultados são obtidos com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade média em relação à polaridade dos componentes da amostra.

A Revelação/visualização pode ser por métodos físicos ou químicos. Compostos UV-ativos, que aparecem como manchas escuras em fundo fluorescente, se a placa F254 for iluminada com lâmpada de luz ultravioleta (Método físico). Quase todas as classes de substâncias orgânicas (exceto alcanos e haletos alifáticos) reagem com iodo formando complexos. A formação desses complexos é reversível. As placas também podem ser borrifadas com outros reveladores (ácido sulfúrico/metanol, vanilina sulfúrica, tricloreto de antimônio, permanganato de potássio/ácido sulfúrico, etc.) (Método químico).

Cromatografia Gasosa

No caso de fases móveis gasosas, separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre os dois tipos está na coluna. Enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária.

A CG é útil para separar compostos a partir de misturas de compostos voláteis. Através de reações químicas com derivados do silano, como o trimetilsilano, substâncias não voláteis podem ser transformadas em produtos de baixo ponto de ebulição. É possível o acoplamento com EM (CG/EM) que é útil na separação e identificação de estruturas, como por exemplo, de óleos voláteis.

Além de possuir um alto poder de resolução, é muito atrativa devido à possibilidade de detecção em escala de nano a picogramas (10-9-10-12 g). A grande limitação deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente, embora amostras não voláteis ou instáveis possam ser derivadas quimicamente. Pode ser utilizada para separações preparativas apenas na faixa de microgramas a miligramas, não sendo muito empregada para esse fim.

Colunas de CGAR são maiores em comprimento, menores em diâmetro, possuem a fase líquida como um filme aplicado diretamente às paredes do tubo da coluna e são mais eficientes. Essas colunas são tubos longos de metais como aço ou cobre, vidro ou teflon.

Colunas de CG têm diâmetro de cerca de 3 mm e comprimento em torno de 3 m, ao passo que colunas de CGAR têm diâmetro na faixa de 0,15-0,75 mm e comprimentos variados, usualmente entre 10 m e 100 m.

Os gases utilizados como fase móvel devem ter alta pureza e ser inertes em relação à fase estacionária. Hidrogênio, nitrogênio e hélio são os mais usados.

A injeção da amostra é feita através de microsseringas ou válvulas semelhantes às utilizadas em CLAE.

Os detectores de maior aplicação são o detector por ionização em chama e o detector de condutividade térmica. Os dados podem ser obtidos através de um registrador potenciométrico, um integrador ou um microcomputador, sendo as amostras identificadas por seus tempos de retenção.

Como a temperatura é um fator extremamente importante, grande parte das análises por cromatografia gasosa é feita com programação de temperatura, obtendo-se melhor separação com picos mais simétricos em menor tempo.

A escolha da fase estacionária é de fundamental importância, sendo ela o componente crítico da coluna. As fases estacionárias podem ser polares, apolares ou quirais. Fases polares são baseadas em polietileno glicol puro ou modificado e apolares em metilsiloxano puro ou modificado. As fases quirais mais comuns são compostas de ciclodextrinas.

Atualmente, espectrômetros de massa têm sido acoplados a equipamentos de cromatografia gasosa, possibilitando a identificação imediata das substâncias presentes na amostra.

Elucidação estrutural

Entre os métodos de analise para determinação estrutural utilizados atualmente estão: a espectrometria de massas, a espectroscopia no UV, no visível e no infravermelho, a ressonância magnética nuclear de próton e carbono 13.

A interpretação de cada um desses espectros pode fornecer diferentes informações qualitativas e quantitativas a respeito da estrutura da substância. Geralmente, com o conjunto de dados espectrais o pesquisador consegue elucidar completamente a estrutura de uma substancia desconhecida. Servem também como instrumentos importantes para a avaliação de qualidade de fitoterápicos, tanto do ponto de vista qualitativo como quantitativo.

O espectro de absorção se uma substancia no UV indica a presença de certos grupos funcionais, bem como a posição dos constituintes no esqueleto da molécula. Assim, por exemplo, os espectros de UV de flavonóides proporcionam informações obre a presença e a posição de grupamentos hidroxila no sistema de anéis, ao mesmo tempo que possibilitam a diferenciação entre os vários tipos de flavonóides.

O espectro de IV de uma substância orgânica corresponde ao conjunto de bandas de absorção apresentadas pela amostra submetida a radiação IV e estas bandas correspondem as mudanças na energia vibracional dos compostos orgânicos. A energia seletivamente absorvida da radiação IV provoca alterações transitórias nas ligações interatômicas, que podem sofrer estiramentos ou deformações nos ângulos de ligação. As freqüências em que ocorrem as vibrações dependem da natureza das ligações em particular, e afetadas também pela vizinhança química e pela molécula como um todo. Se um espectro de IV de uma substancia desconhecida for sobreponível ao de uma amostra autentica conhecida isso pode servir como uma prova de identidade.

O espectro de massas (EM) pode fornecer importantes informações relacionadas com a estrutura, como massa molecular e padrões de fragmentação. O peso molecular estabelece a formula molecular da substancia, e o padrão de fragmentação pode ajudar a caracterizar a presença, bem como a localização de certos grupos funcionais e cadeias laterais. O espectrômetro de massas pode ser acoplado ao CLAE e ao CG, que permitem tanto a identificação quanto a quantificação de componentes de baixo peso molecular, mesmo em misturas complexas.

A RMN é extremamente útil na determinação estrutural de compostos orgânicos, contribuindo para o estabelecimento do esqueleto da molécula. Submete-se a amostra a um campo magnético externo, de forma que determinados núcleos que apresentam um momento magnético nuclear (núcleos com numero de massa impar como 1H, 13C, 31P) podem entrar em ressonância com a radiofreqüência aplicada, absorvendo energia eletromagnética em freqüências características para cada núcleo, conforme sua vizinhança química. É importante para a elucidação estrutural de praticamente todas as classes de produtos naturais, incluindo metabolitos secundários vegetais.

Espectros de RMN de 1H e 13C são os mais utilizados e sua interpretação permite caracterizar o numero e o tipo de átomos de H e C, em função da localização e do desdobramento dos sinais correspondentes a absorção de energia eletromagnética. A grande variedade de técnicas disponíveis de RMN (COSY, NOESY, HETCOR, HMBC, INEPT, INADEQUATE, COLOC, etc) permite identificar a proximidade espacial ou mesmo a conectividade de alguns átomos em particular, auxiliando, dessa maneira, na montagem da molécula.

A determinação da atividade óptica e a cristalografia por raios-X podem ser necessárias para o estabelecimento da estereoquímica de moléculas apresentando centros de assimetria.

O conjunto de informações obtidas através da interpretação de diferentes espectros que se consegue estabelecer, de forma inequívoca, as estruturas de moléculas desconhecidas.

PARTE EXPERIMENTAL: PRINCIPAIS CUIDADOS E DIFICULDADES

Um dos fatores importantes no estudo de plantas consiste na experiência dos pesquisadores envolvidos. Muitas vezes, a falta de experiência leva a erros que podem tanto comprometer os resultados experimentais como dispender maior tempo e recursos e não atingir os objetivos almejados. Assim, pode-se enumerar alguns cuidados que devem ser tomados em laboratório quando se busca obter compostos bioativos:

1) Seleção do material vegetal: Um dos cuidados que deve ser levado em consideração envolve informações sobre possíveis efeitos tóxicos da planta a ser selecionada. Plantas que tenham o nome popular de mata-boi, mata-cavalo, etc, devem ser vistas com restrições, já que a presença de constituintes tóxicos pode comprometer todo o estudo realizado. A planta a ser investigada deve ser classificada com segurança e a coleta deve ser feita com muito cuidado para não serem agregadas outras espécies diferentes. Também deve ser levada em consideração a quantidade de planta que viceja no local de coleta, para que os estudos não fiquem prejudicados. A secagem, em estufa (40 ºC) ou à sombra à temperatura ambiente deve ser procedida logo após a coleta para evitar a proliferação de fungos. Caso se deseje armazenar o material vegetal, o mesmo pode ser acondicionado em freezer. Na preparação dos extratos, a planta deve estar completamente fresca ou totalmente seca para definir com melhor exatidão o rendimento tanto da massa bruta como dos constituintes químicos.

2) Solvente: A escolha do solvente é de fundamental importância tanto para a obtenção de extratos como para utilizá-lo como eluente em cromatografia em coluna. Impurezas, como ftalatos, usados como estabilizantes de plásticos, podem ser transferidas para o extrato e também dificultar o isolamento dos constituintes naturais. Outro aspecto que deve ser verificado é a presença de água, que influencia significativamente nas separações cromatográficas. A formação de artefatos na preparação de extratos é muito comum. Isto ocorre, geralmente, quando se aquece demais determinado extrato ou se usa um solvente inadequado para extração. Por exemplo, o clorofórmio, que geralmente contém HCl, quando usado para extração, pode fornecer produtos não naturais formados pela ação do ácido. A acetona também deve ser usada com restrição, já que pode reagir com alguns compostos que contém o grupo amino.

3) Testes biológicos: A avaliação dos efeitos biológicos tanto “in vitro”como “ in vivo” depende de vários fatores, tanto estruturais quanto experimentais. É essencial que a Instituição de pesquisa possua um bom biotério e um laboratório exclusivo para a realização dos experimentos, e a escolha dos modelos deve ser de maneira que possam ser reproduzidos corretamente e evitados os resultados falso-positivos. Os experimentos devem ser repetidos várias vezes para se obter dados estatísticos que comprovem a eficácia do material testado.

Referências bibliográficas

Barbosa WLR, Quignard E, Tavares ICC, Pinto LN, Oliveira FQ, Oliveira RM. Manual para análise fitoquímica e cromatográfica de extratos vegetais. Universidade Federal Do Pará. Revista Científica da UFPA http://www.ufpa.br/rcientifica Vol 4, 2004.

Cechinel Filho V, Yunes RA. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Química Nova, 21(1), 99-105, 1998.

Degani ALG, Cass QC, Vieira PC. Cromatografia um breve ensaio. Química Nova na Escola, Cromatografia n° 7, 1998.

Simões CMO, Schenkel EP, Gosmam G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6 ed. Porto Alegre: Editora da UFRGS; 2007.