Verificação da Atividade Antifúngica de Extratos de Plantas e Óleo de Eucalipto

Veterinária

21/06/2012

 As dermatofitoses ou dermatomicoses são infecções das estruturas queratinizadas como unhas, pêlos e camada córnea da pele causadas por fungos dos gêneros Microsporum, Trichophyton e Epidermophyton (14, 25, 33), que incluem cerca de quarenta espécies, das quais somente algumas, pertencentes aos gêneros Microsporum e Trichophyton são usualmente as causas de dermatofi tose em animais domésticos(3, 14, 25). Os animais servem como reservatórios de dermatófi tos zoofílicos e suas infecções possuem importância zoonótica(3). A dermatofi tose é uma doença extremamente contagiosa, não apenas entre os animais, mas também dos animais para o homem, em contato com gatos, cães, cavalos entre outros, caracterizando-se assim, uma zoonose (14, 20, 25, 33).

Os dermatófi tos zoofílicos como M. canis, T. verrucosum e T. mentagrophytes constituem em importantes agentes de tinhas em humanos (3). Além dos dermatófi tos, outros fungos tem sido apontados como agentes de dermatofi tose e tem despertado grande interesse na Medicina Veterinária, são os fungos sapróbios, comumente isolados de cães e gatos e que pertencem aos gêneros Aspergillus spp e Penicillium spp (6, 18). As espécies de Aspergillus estão amplamente distribuídas entre os fungos fi lamentosos saprofíticos, e embora o gênero contenha mais de cem espécies, somente um número limitado tem sido implicado em infecções oportunísticas em animais e humanos (25).

Fungos sapróios podem ser achados no solo, ar, plantas e outros materiais, os quais estão em contato constante com os animais (10, 15). Em seres humanos doenças crônicas, terapias anticancerígenas, tratamentos prolongados com antibióticos, terapias com esteróides, alguns fungos comumente considerados sapróbios podem assumir propriedades patogênicas e invadir tecidos, por esta razão é muito importante distinguir os fungos patogênicos dos sapróbios (22). Resultados de pesquisas sugerem como possíveis agentes etiológicos de dermatomicoses em gatos e cães os fungos sapróbios dos gêneros Alternaria, Rhizopus, Chaetomium, Cladosporium, Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, Candida, Fusarium e Curvularia (22).

O tratamento das dermatofi toses deve ser direcionado para a erradicação do material infeccioso dos animais afetados, dos portadores e do ambiente. Para tal fi nalidade, fi cam indicados os cortes dos pêlos, o isolamento apropriado, as medidas sanitárias, a terapia tópica e a administração sistêmica de medicamentos fungicidas ou fungiostáticos (25). Atualmente, em todos os lugares do mundo, a intervenção para o controle de doenças animais é largamente realizada por meio do uso de fármacos. A lista de substâncias químicas com ação antifúngica é bastante extensa, porem como as infecções por fungos representam o parasitismo de um organismos eucariótico sobre outro eucariótico (animal e homem), com diferenças fi siológicas muito pequenas é necessário que as drogas antifúngicos tenham aplicação clínica adequada com o mínimo de efeitos colaterais (30). As substancias antifúngicas mais utilizadas são os imidazóis, triazóis, fl ucitosina, alilaminas, antibióticos poliénicos e griseofulvina (19, 21, 24).

Sem dúvida, o uso racional desses produtos pode ter um efeito positivo, no entanto em longo prazo, além do surgimento de microrganismos resistentes às substâncias químicas utilizadas, os resultados para a sociedade como um todo e para o meio ambiente podem tornar-se negativos devido à poluição causada pelos resíduos (19, 21). Na atualidade, muitas instituições têm se empenhado na utilização de tratamentos alternativos para o controle de diferentes agentes etiológicos de doenças. O tratamento à base de plantas medicinais, ou fi toterapia, está ganhando força inédita mundial. (2). Devido a este motivo, o presente trabalho teve como objetivo determinar a ação antifúngica de extratos de plantas medicinais e óleo de eucalipto frente ao fungo sapróbio Aspergillus niger, com o intuito de verifi car a potencialidade de utilização como um método alternativo de tratamento. O experimento foi conduzido no Laboratório de Microbiologia, da Universidade Camilo Castelo Branco, Campus de Fernandópolis, São Paulo. Foi utilizado para avaliação da atividade antifúngica dos extratos de plantas e óleo de eucalipto o fungo sapróbio Aspergillus niger isolado de pêlo de cães. Este fungo foi escolhido, pois é o sapróbio mais frequente encontrado na microbiota normal dos pêlos dos cães e no ambiente, e em caso de baixa imunidade, este fungo pode causar graves casos de dermatofi tose pelo fato de ser oportunista.

Na preparação do extrato bruto foram utilizadas folhas de arruda (Ruta graveolens), citronela (Cymbopogon nardus), tiririca (Cyperus rotundus), cravo de defunto (Tagetes minuta), eucalipto (Eucalyptus spp), graviola (Annona moricata), fruta do conde (Annona spp), manga (Mangifera indica), romã (Punica granatum), folhas e fl ores de calêndula (Calendula spp), e fl ores e folhas de primavera (Bougainvillea glabra) obtidas da coleção de plantas da Faculdade de Ciências Agrárias, UNICASTELO, Campus Fernandópolis. Os extratos brutos foram preparados utilizando-se 300grs de folhas, previamente lavadas, e 450mL de água deionizada. O material vegetal foi misturado e triturado em liquidifi cador, esta mistura foi posteriormente coada e fi ltrada, e em seguida, os extratos foram esterilizados em autoclave por 15 minutos, a uma atmosfera de pressão. Os extratos brutos foram conservados a 10 ºC + 2ºC. Para a determinação da atividade antifúngica de extratos de plantas e óleo de eucalipto foi utilizado meio Sabouraud dextrose (Difco), preparado de acordo com as instruções do fabricante. O meio foi retirado da autoclave e resfriado até atingir 50ºC, momento no qual foram adicionados e misturados perfeitamente os extratos brutos de plantas e óleo de eucalipto. Para cada concentração e cada tipo de extrato foram preparados 100mL de meio de cultura Sabouraud.

As concentrações avaliadas foram de 0,5 a 10% (v/v). Foram empregadas placas de Petri (10 x 90mm) nas quais foram depositados 15mL de meio de cultivo, o mesmo permaneceu na câmara de fl uxo laminar até total solidifi cação. Uma vez solidifi cado, o meio foi inoculado com discos de micélio (1,5 mm) retirados de uma cultura de A. niger. Placas de Petri contendo meio Sabouraud sem adição do extrato, foram utilizadas como controle. Para cada tratamento foram utilizadas quatro repetições. As placas foram mantidas em incubadora B.O.D. a temperatura de 36 + 0,5ºC sem luminosidade, até o desenvolvimento do fungo, usando como parâmetro de crescimento a placa controle sem adição do extrato. O desenvolvimento do fungo foi analisado diariamente. A avaliação da atividade antifúngica dos extratos foi realizada pela medição do diâmetro das colônias. Uma vez determinados os extratos com poder antifúngico foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (MIC) dos extratos e do óleo de eucalipto.

A atividade fungicida de diferentes extratos brutos e óleo de eucalipto foram avaliadas, in vitro, contra o fungo sapróbio Aspergillus niger. Os resultados obtidos do cultivo de A. niger, em meio de cultivo Sabouraud suplementado com doses crescentes de extratos brutos de plantas, foram diferentes para cada extrato. As avaliações in vitro realizadas para avaliar o efeito de extratos de plantas sobre o desenvolvimento de Aspergillus niger mostraram que nenhum dos extratos apresentou atividade fungicida. Os extratos de folhas e fl ores de primavera, de folhas de calêndula, tiririca e eucalipto induziram o desenvolvimento do fungo com adição de apenas 1 mL de extrato em 15 mL do meio de cultura. Por outro lado, o óleo de eucalipto inibiu o crescimento de Aspergillus niger com uma MIC de 340 µl (Figura 1). Discussão Na maioria dos lugares do mundo o controle de doenças é realizado através de fármacos antimicrobianos (19, 21, 24). A utilização racional desses produtos pode ter, efeitos positivos, no entanto, em longo prazo, podem ser negativos como resultado do surgimento de isolados resistentes às substâncias utilizadas (19, 21). Todavia, somente os fármacos não serão capazes de resolver a crescente problemática das infecções fúngicas.

Melhorias no diagnóstico de tais infecções, que propiciem maior rapidez no início da terapia e a escolha apropriada do antifúngico; além de profi laxia efi caz e desenvolvimento de medicamentos que aumentem a capacidade de resposta dos organismos também são necessários (2). A dermatofi tose é a infecção fúngica superfi cial mais comum na medicina veterinária de pequenos animais (5). As drogas utilizadas no tratamento desta infecção geralmente provocam efeitos colaterais, alguns com efi cácia limitada (4, 13, 19, 21). Em função desses efeitos, a tendência atual é a utilização de fi toterápicos no controle e tratamento de microrganismos patogênicos (6, 7, 12, 16). Nas últimas décadas observou-se um grande interesse pelo potencial terapêutico de plantas medicinais (9, 16, 17, 23, 26, 28, 35). Além disso, sabe-se que cerca de 30% das drogas prescritas no mundo são obtidas direta ou indiretamente de plantas (16). A fi toterapia é uma forma de controle de agentes etiológicos através da utilização dos metabólitos secundários produzidos pelas plantas. Esta tecnologia está sendo utilizada com êxito no controle de insetos, pragas e algumas doenças (12, 32) razão que levou o desenvolvimento deste trabalho.

Alguns metabólitos isolados ou frações de extratos de plantas têm demonstrado atividade antifúngica, como por exemplo, o óleo essencial de Lantana aculeata com atividade contra Aspergillus fl avus, A. niger, A. fumigatus, Microsporum gypseum, Penicillum e Rhizophus stolonifer e o extrato etanólico de folhas de Hyptis ovalifolia contra alguns dermatófi tos (29, 32). A atividade antifúngica dos óleos essenciais extraídos de limão e citronela, e de alguns componentes dos óleos essenciais citral, geraniol, citronelol e citronelal foram testados em quatro fungos patogênicos (Cândida albicans, Microsporum gypseum, Sporothrixschenckii e Aspergillus niger), sendo que o óleo de limão apresentou alta atividade antifúngica para todos os organismos testados e o óleo de citronela foi efi ciente para Microsporum gypseum (7). A efi ciência de extratos etanólicos de Cassia alata e Senna alata foi verifi cada no controle de diversas espécies de fungos como: M.canis, T. mentagrophytes, Aspergillus fl avus, Candidas albicans e Monosporascus cannonballus (17, 34). No presente trabalho verifi cou-se a efi ciência do óleo de eucalipto no controle de Aspergillus niger. Em uma pesquisa realizada utilizando 60 amostras de dermatófi tos fi cou demonstrado que a fração aquosa do extrato de Hyptis ovalifolia inibiu o crescimento de 40% das amostras e o óleo essencial desta mesma planta inibiu o crescimento de 100% das amostras testadas (32).

Outros autores também perceberam que extratos brutos de algumas plantas possuíam ação inibitória contra Cryptococcus neoformans (23). Outros já descreveram que o óleo essencial de Eugenia dysenterica tem uma boa ação contra Cryptococcus neoformans e que o óleo de H. suaveolens possui atividade contra Candida albicans (1, 6). Vários fatores podem influenciar a atividade antifúngica de extratos de plantas, como por exemplo, o ambiente ao qual a planta foi submetida, a fatores genéticos, a utilização de diferentes métodos de extração, ao pH, a temperatura e ao uso de diferentes concentrações (34). Como as amostras do material vegetal para produção dos extratos brutos, utilizado nesta pesquisa, foi colhido na mesma época e o método de extração foi o mesmo para todas as plantas pode-se afirmar que estes fatores não interferiram nos resultados obtidos. Vários trabalhos mostram que o uso de diferentes concentrações pode interferir nos resultados obtidos em experimentos onde foram utilizadas as mesmas espécies vegetais (26, 31). Acreditase que esta foi à razão pela qual nenhum dos extratos vegetais utilizados neste trabalho demonstrou eficiência contra o fungo testado. Já a composição dos óleos essenciais é determinada por fatores genéiticos, porém, fatores ambientais podem causar variações significativas em seus componentes.

A época e local de colheita, horário, o modo de secagem e preparo, a umidade e o solo onde são cultivadas as plantas podem influenciar no teor do óleo extraído (11, 28). Os óleos essenciais de eucalipto são compostos formados por uma complexa mistura de componente voláteis, apresentando grupos químicos como: hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos e ésteres (27). Como as substancias encontradas nos óleos de eucalipto apresentam grupo alcoólico, carbonilas e duplas ligações, é provável acontecem processos oxidação ou os compostos são metabolizados para outras substâncias provocando a inibição de crescimento e alteração da cor dos micélios fúngicos (27). A atividade antifúngica do óleo de eucalipto no combate ao A. niger mostra a possibilidade de ser utilizado, após testes in vivo, como método alternativo de tratamento dermatofitose em cães causada por este fungo, porem devem ser realizadas pesquisas com a finalidade de avaliar doses e eficiência e por fim realizar as recomendações pertinentes para as diferentes espécies animais.

Conclui-se que, o óleo de eucalipto apresentou atividade antifúngica para Aspergillus niger, demonstrando que é possível utilizá-lo como método alternativo para tratamentos de doenças causadas por este fungo, porém, testes in vivo devem ser realizados para adequação do método de aplicação (loção, sabonete, pomada, gel tópico). Os extratos vegetais testados não foram eficientes contra o Aspergilus niger tornando inutilizável o uso destes fitoterápicos contra este tipo de fungo. Em contrapartida, os extratos de folhas e flores de primavera e de folhas de calêndula induziram o desenvolvimento do fungo razão pela qual não é recomendável a sua utilização no tratamento de A. niger. Os resultados obtidos neste experimento deixam claro que a utilização de fitoterápicos deve ser feita sob a supervisão de profissionais, evitando assim um possível agravamento da doença.


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